Preservação de fertilidade: cultivo de folículos ovarianos e novo dispositivo para criopreservação seminal / Fertility preservation: ovarian follicle culture and a new device for seminal cryopreservation

INTRODUÇÃO: A oncofertilidade tem o desafio de buscar estratégias para preservar a função reprodutiva. Este estudo explorou duas possibilidades como implementação para as técnicas de preservação da fertilidade feminina e masculina. OBJETIVO: Analisar a eficiência do cultivo de folículos pré-antrais de camundongos suplementado com lisado de plaquetas humanas e desenvolver um protótipo para criopreservação de sêmen humano. MATERIAIS E MÉTODOS: Os folículos pré-antrais foram isolados mecanicamente de ovários de fêmeas de camundongos e foram cultivados individualmente em sistema entre camadas de óleo mineral. Os folículos foram cultivados divididos em 4 grupos, sendo um controle, sem o uso do lisado de plaquetas e três grupos com diferentes concentrações de lisado de plaquetas humanas (PLTMax®). Foram avaliadas a sobrevivência celular, desenvolvimento folicular e características oocitárias. Para o segundo estudo foi desenvolvido e impresso em 3D com filamentos de acrilonitrilo butadieno-estireno (ABS) um protótipo que suporte 10 palhetas com amostras seminais no vapor de nitrogênio líquido (N2L), etapa essencial para criopreservação de sêmen humano. Para os testes foram utilizadas 40 amostras seminais. A temperatura ambiente e no interior das palhetas de envase das amostras foram medidas e estabelecida a curva de resfriamento. Os parâmetros de motilidade, vitalidade e fragmentação do DNA espermático foram avaliados antes do congelamento e após o descongelamento. Foram realizados dois testes, um de posicionamento das palhetas e outro comparativo entre o protótipo e um dispositivo com suporte em poliestireno expandido (EPS). RESULTADOS: O cultivo de 11 dias induziu um aumento no tamanho folicular em todas as condições, sendo maior no grupo controle, seguido do grupo com 10% de PLTMax®, mas com diferença significativa (p<0,001). O grupo controle apresentou maior número de oócitos intactos (>50%) em relação aos demais (<35%). Todos os 4 grupos apresentaram taxas de vitalidade celular acima de 70%. Quanto aos testes com o protótipo em ABS foi verificado que as curvas de refrigeração foram notavelmente reproduzíveis. O material do protótipo resistiu a inúmeros mergulhos (>300) no N2L, sem demonstrar danos ao material. Diferenças significativas (p<0,001) foram observadas para a taxa de recuperação média da motilidade e vitalidade espermática em relação aos dados da amostra 2 fresca em ambos os testes. A motilidade, a vitalidade e a fragmentação do DNA espermático antes do congelamento e após o descongelamento não mostraram diferenças em relação a posição das palhetas. Também não houve diferença quanto ao índice de fragmentação verificada das amostras criopreservadas com uso do protótipo em ABS e o suporte em EPS, mesmo após o cultivo, após 24 horas de cultivo. Contudo, houve diferença em relação a amostra fresca (p<00,1). Quanto a recuperação das taxas de motilidade e vitalidade não houve diferença entre o ABS e EPS após o descongelamento e 24 horas de cultivo. CONCLUSÃO: O PLTMax®, embora tenha apresentado menor desempenho que o HSA, é um candidato de suplementação para o cultivo de folículos pré-antrais que merece ser mais explorado. O protótipo em ABS demonstrou resistência, praticidade e segurança para criopreservação seminal de forma reprodutível e eficiente.

INTRODUCTION: Oncofertility has the challenge of seeking strategies to preserve reproductive function. This study explored two possibilities as implementations for female and male fertility preservation techniques. PURPOSE: To analyze the efficiency of mouse preantral follicle culture supplemented with human platelet lysate and to develop a prototype for human semen cryopreservation. MATERIAL AND METHODS: Preantral follicles were mechanically isolated from female mouse ovaries and were individually cultured using a mineral oil interlayer system. The follicles were cultured divided into 4 groups, one control, without the use of platelet lysate and three groups with different concentrations of human platelet lysate (PLTMax®). Cell survival, follicular development and oocyte characteristics were evaluated. For the second study, a prototype was developed and printed in 3D with acrylonitrile butadiene styrene (ABS) filaments to support 10 straws with seminal samples in liquid nitrogen (N2L) vapor, an essential step for human semen cryopreservation. For the tests 40 seminal samples were used. Ambient and internal temperatures inside the sample straws were measured and the cooling curve was established. The parameters of motility, vitality and sperm DNA fragmentation were evaluated before freezing and after thawing. Two tests were performed, one for positioning the straws and the other comparing the prototype and a device with expanded polystyrene (EPS) support. RESULTS: The 11-day culture induced an increase in follicular size in all conditions, being higher in the control group followed by the group with 10% PLTMax®, but with significant difference (p<0.001). The control group presented a higher number of intact oocytes (>50%) compared to the others (<35%). All 4 groups presented cell vitality rates above 70%. As for the ABS prototype tests, it was verified that the cooling curves were remarkably reproducible. The prototype withstood numerous dips (>300) in N2L without showing damage to the material. Significant differences (p<0.001) were observed for the mean recovery rate of sperm motility and vitality compared to the fresh sample data in both tests. Motility, vitality and sperm DNA fragmentation before freezing and after thawing showed no differences with respect to the position of the straws. There was also no difference in the fragmentation index verified for samples cryopreserved using the ABS prototype and the EPS support, even after 24 hours of culture. However, there was a difference compared to the fresh 4 sample (p<00.1). As for the recovery of motility and vitality rates there was no difference between ABS and EPS after thawing and 24 hours of culture. CONCLUSION: PLTMax®, although it showed lower performance than HSA, is a supplementation candidate for preantral follicle culture that deserves further exploration. The ABS prototype demonstrated strength, practicality and safety for seminal cryopreservation in a reproducible and efficient manner.

One Plus One is Better than Two: An Approach Towards a Single Blastocyst Transfer Policy for All IVF Patients / Um mais um é melhor que dois: Uma abordagem pela prática da transferência de embrião único para todos os pacientes de FIV

Abstract Objective It is known that the single embryo transfer (SET) is the best choice to reduce multiples and associated risks. The practice of cryopreserving all embryos for posterior transfer has been increasingly performed for in vitro fertilization (IVF) patients at the risk of ovarian hyperstimulation syndrome or preimplantation genetic testing for aneuploidy. However, its widespread practice is still controverse. The aim of this study was to evaluate how effective is the transfer of two sequential SET procedures compared with a double embryo transfer (DET) in freeze-only cycles. Methods This retrospective study reviewed 5,156 IVF cycles performed between 2011 and 2019, and 506 cycles using own oocytes and freeze-only policy with subsequent elective frozen-thawed embryo transfers (eFET) were selected for this study. Cycles having elective SET (eSET, n = 209) comprised our study group and as control group we included cycles performed with elective DET (eDET, n = 291). In the eSET group, 57 couples who had failed in the 1st eSET had a 2nd eFET, and the estimated cumulative ongoing pregnancy rate was calculated and compared with eDET. Results After the 1st eFET, the ongoing pregnancy rates were similar between groups (eSET: 35.4% versus eDET: 38.5%; p =0.497), but the estimated cumulative ongoing pregnancy rate after a 2nd eFET in the eSET group (eSET + SET) was significantly higher (48.8%) than in the eDET group (p < 0.001). Additionally, the eSET +SET group had a 2.7% rate of multiple gestations, which is significantly lower than the eDET group, with a 30.4% rate (p < 0.001). Conclusion Our study showed the association of freeze-only strategy with until up to two consecutive frozen-thawed eSETs resulted in higher success rates than a frozenthawed DET, while drastically reducing the rate of multiple pregnancies.

Resumo Objetivo Sabe-se que a transferência de embrião único (SET) é a melhor escolha para reduzir as gestações múltiplas e riscos associados. A prática da criopreservação de todos os embriões para transferência posterior tem sido cada vez mais utilizada para fertilização in vitro (FIV), em especial quando há risco de síndrome de hiperestimulação ovariana ou realização de teste genético pré-implantacional. Entretanto, sua utilização disseminada ainda é controversa. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de duas SET sequenciais em comparação com uma transferência de embrião dupla (DET) em ciclos de FIV onde todos os embriões foram criopreservados. Métodos Neste estudo retrospectivo foram revisados 5.156 ciclos de FIV realizados entre 2011 e 2019, e 506 ciclos usando oócitos próprios e criopreservação de todos os embriões com transferências eletivas subsequentes de embriões descongelados, foram selecionados para este estudo. Ciclos com transferência eletiva de embrião único (eSET, n = 209) compuseram nosso grupo de estudo e como grupo de controle incluímos os ciclos com transferência eletiva de dois embriões (eDET, n = 291). No grupo eSET, 57 casais que falharam na 1ª tentativa de eSET tiveram uma 2ª eFET e a taxa de gravidez em curso cumulativa foi estimada para o grupo eSET e comparada com o grupo eDET. Resultados Após a 1ª eFET, as taxas de gravidez em curso foram semelhantes entre os grupos (eSET: 35,4% versus eDET: 38,5%; p = 0,497), mas a taxa de gravidez em curso cumulativa estimada após a 2ª eFET no grupo eSET (eSET + SET) foi significativamente maior (48,8%) do que no grupo eDET (p <0,001). Além disso, as taxas de gestação múltipla foram expressivamente inferiores no grupo eSET + SET (2,7%) quando comparado ao grupo eDET (30,4%; p < 0,001). Conclusão Nosso estudo mostrou que a associação das estratégias de congelamento de todos os embriões com até duas eSETs sequenciais resultou em maiores taxas de sucesso do que uma DET com embriões descongelados, além de reduzir drasticamente a ocorrência de gestações múltiplas.

Processamento e conservação de enxertos de pele: uma abordagem com foco nos métodos de criopreservação, liofilização e glicerolização / Skin grafts processing and conservation: an approach focusing on cryopreservation, freeze-drying and glycerol conservation methods

Introdução: o uso de substitutos cutâneos para o tratamento de diversas feridas graves é uma forma eficiente de prevenir infecções e favorecer o processo de reepitelização. No entanto, tecidos biológicos estão suscetíveis a degradação e contaminação. Por isso, devem ser submetidos a rigorosos protocolos de processamento e testes que comprovem suas contribuições benéficas e segurança de aplicação. Objetivo: trazer uma abordagem sobre as principais características dos métodos de criopreservação, glicerolização e liofilização e sua consequencia nos aspectos imunológicos, microbiológicos e de viabilidade tecidual de enxertos de pele humana. Metodologia: foi realizada uma busca online utilizando as palavras chaves "criopreservação", "liofilização", "glicerolização", "enxertos", "processamento tecidual" e "engenharia dos tecidos" em múltiplas combinações nos bancos de dados PubMed, LILACS e ScienceDirect. Resultados: 200 artigos científicos foram obtidos, 26 excluídos por duplicidade, 92 selecionados para leitura integral a partir da leitura de seus resumos e 27 utilizados na construção desta revisão. A liofilização e a glicerolização são métodos semelhantes considerando a viabilidade tecidual. O uso de glicerol traz como principal desvantagem sua citotoxicidade quando comparado aos outros métodos. A criopreservação mantém os tecidos viáveis. Contudo, pode ser mais cara e trazer riscos de transmissão de microorganismos patogênicos. De modo geral, não é bem estabelecido quais os melhores métodos de conservação para uma adequada conservação da viabilidade dos enxertos de pele. Considerações Finais: os 3 métodos, liofilização, glicerolização e criopreservação, possuem aplicabilidade na conservação de enxertos. A falta de padronização na aplicação de enxertos apesar de sua frequente aplicação e a escassez de estudos recentes sobre o tema justificam o presente estudo.

Introduction: the use of skin substitutes for treatment of several wounds is an efficient way to prevent infections and allow the re-epithelialization process. However, biological tissues are susceptible to degradation and contamination. Therefore, they must undergo rigorous processing and testing protocols that prove their beneficial contributions and application security. Objective:to bring an approach on the main characteristics of cryopreservation, freeze-drying and glycerol conservation methods and their implications on immunological, microbiological and tissue viability aspects when applied to human skin grafts. Methodology:a mostly online search was performed using the keywords "cryopreservation", "freeze-drying", "glycerol conservation", "grafts", "tissue processing" and "tissue engineering" in multiple combinations in PubMed, LILACS and ScienceDirect databases. Results: 200 scientific articles were rescued, 26 excluded by duplicity, 92 selected for full reading from the reading of their abstracts and 27 used in the construction of this review. Freeze-drying and glycerol conservation are similar methods, with glycerol conservation having greater economic advantage. The use of glycerol presents cytotoxicity when compared to the other methods. Cryopreservation keeps tissues viable, however, is more expensive and carry risks of transmission of pathogenic microorganisms. Overall, there is a lack of clarity about the importance of viability in the performance of skin grafts. Final considerations: the 3 methods have applicability in graft conservation. The lack of standardization in graft application despite its frequent application and the scarcity of recent studies on the subject justify the present study.

Avaliação da aplicabilidade de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano bovino / Evaluation of the applicability of synthetic polymers in the vitrification of bovine ovarian tissue

A preservação da fertilidade em pacientes com câncer objetiva assegurar a saúde reprodutiva. A criopreservação de tecido ovariano é a única técnica disponível para meninas pré-púberes e para casos em que o tratamento não pode ser adiado. A técnica de vitrificação está associada a uma melhor preservação de fragmentos do córtex ovariano quando comparada ao congelamento lento. Estudos preliminares demonstraram que a combinação de polímeros sintéticos na vitrificação preservou melhor o tecido e os folículos secundários no córtex de ovários de macacos, por serem miméticos às proteínas naturais responsáveis pela proteção conferida a alguns organismos durante o inverno. A técnica de vitrificação associada a polímeros sintéticos é uma alternativa promissora, mas ainda não está disponível um protocolo padrão que demonstre resultados consistentes. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a aplicabilidade de polímeros sintéticos na criopreservação por vitrificação de tecido ovariano bovino. Ovários bovinos foram obtidos a partir de animais abatidos para consumo em um abatedouro local. O córtex foi extraído e cortado em fragmentos. Os fragmentos foram divididos em três grupos (controle fresco, vitrificação com (CP) e sem (SP) adição de polímeros sintéticos). Os fragmentos de tecido de todos os grupos antes e após aquecimento foram fixados em paraformaldeído a 4%, corados com hematoxilina e eosina para avaliação de morfologia, contagem e observação do estágio folicular. Parte dos fragmentos tiveram seus folículos secundários isolados mecanicamente e cultivados em matriz de alginato até atingirem o estágio antral. Durante o cultivo, para análise de viabilidade, foram avaliados a sobrevida, crescimento e formação de antro folicular. Para avaliação da funcionalidade folicular, o meio de cultivo foi coletado para posterior dosagem de esteróides ovarianos. Então, os três grupos foram comparados estatisticamente. Os tecidos ovarianos vitrificados apresentaram uma morfologia com sinais de injúria, com espaços vazios e menos densos, além de exibirem uma menor porcentagem de folículos normais quando comparados ao tecido fresco (Fresco x CP p<0,0001; Fresco x SP p=0,0004). Contudo, não foi observada diferença entre os grupos vitrificados com e sem polímeros (CP x SP p = 0,7173). Os folículos que passaram pela vitrificação apresentaram uma sobrevida similar entre si e menor que o controle fresco (χ²(2) = 19,87; p< 0,0001). Todos os grupos avaliados foram semelhantes na taxa de formação de antro (χ²(1) = 0,6569; p< 0,4176). Em todos os grupos houve crescimento folicular durante o cultivo. No entanto, os folículos frescos e com adição de polímeros aumentaram de diâmetro durante todo o cultivo, ao passo que os folículos sem adição de polímeros cresceram apenas na primeira semana. No fim do cultivo, os folículos que passaram pelo processo de vitrificação produzem menos hormônios que os frescos (p < 0,05), mas sem diferença entre SP e CP. A partir desses resultados, é possível concluir que a combinação do uso de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano é uma técnica promissora, que poderá proteger o desenvolvimento folicular, mas são necessários mais estudos que possam aperfeiçoar esse protocolo.

The preservation of fertility in cancer patients aims to ensure reproductive health. Ovarian tissue cryopreservation is the only technique available for prepubescent girls and for cases where treatment cannot be delayed. The vitrification technique is associated with better preservation of ovarian cortex fragments when compared to slow freezing. Preliminary studies in the cortex of monkeys' ovaries have shown that the combination of synthetic polymers in vitrification is better to preserve the tissue and secondary follicles, as they are mimetic to the natural proteins responsible for the protection during the winter in some organisms. The vitrification technique associated with synthetic polymers is a promising alternative, but a standard protocol that demonstrates consistent results is not yet available. Thus, this work aimed to evaluate the applicability of synthetic polymers in cryopreservation by vitrification of bovine ovarian tissue. Bovine ovaries were obtained at a local abattoir. The cortex was extracted and cut into fragments. The fragments were divided into three groups (fresh control, vitrification with (CP) and without (SP) addition of synthetic polymers). Tissue fragments from all groups before and after heating were fixed in 4% paraformaldehyde, stained with hematoxylin and eosin for morphology assessment, counting and observation of the follicular stage. Part of the fragments had their secondary follicles mechanically isolated and cultivated in alginate matrix until they reached the antral stage. During cultivation, for viability analysis, survival, growth and follicular antrum formation were evaluated. To evaluate the follicular functionality, the culture medium was collected for later measurement of ovarian steroids. The vitrified ovarian tissues presented a morphology with signs of injury, with empty and less dense spaces, in addition to showing a lower percentage of normal follicles when compared to fresh tissue (Fresh control x CP p< 0.0001). All groups evaluated were similar in the rate of antrum formation (χ²(1) = 0.6569; p< 0.4176). In all groups there was follicular growth during cultivation. However, fresh and polymer-added follicles increased in diameter throughout the cultivation, whereas follicles without polymer additions grew only in the first week. At the end of cultivation, the follicles that underwent the vitrification process produced less hormones than the fresh ones (p < 0.05), but there was no difference between SP and CP. From these results, it is possible to conclude that the combination of the use of synthetic polymers in the vitrification of ovarian tissue is a promising technique, which may protect follicular development, but further studies are needed to improve this protocol.

Biobancos privados, biotecnologias e as promessas de segurança biológica / Private biobanks, biotechnologies and the promises of biological security / Biobancos privados, biotecnologías y las promesas de seguridad biológica

INTRODUÇÃO: Este artigo tem o objetivo de compreender como a adesão à biotecnologia de armazenamento de células-tronco do cordão umbilical para uso autólogo produz a adoção de práticas, no presente, que visam prevenir riscos em nome de segurança biológica no futuro. MÉTODO: O material empírico foi constituído de depoimentos extraídos de sites de biobancos privados credenciados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), analisados a partir da análise do discurso. RESULTADOS: as publicações dos sites estimulam o consumo do armazenamento de células-tronco do cordão umbilical, em nome da obtenção de segurança biológica para o futuro. Discussões: Esta busca é povoada por discursos de riscos que oferecem "garantias" relacionadas a futuros somáticos, associados a práticas educativas que produzem formas de cuidar dos filhos. CONCLUSÃO: Tais discursos produzem significados acerca de questões que envolvem segurança biológica e riscos, inscrevendo pais e mães em práticas de hiperprevenção em saúde.

INTRODUCTION: This article aims to understand how adherence to biotechnology of stem cell storage of umbilical cord for autologous use produces the adoption of practices, in the present, that aim to prevent risks in the name of biological security in the future. METHOD: The empirical material consisted of testimonies extracted from private biobank sites accredited by ANVISA, analyzed from the analysis of the discourse. RESULTS: the websites' publications encourage the consumption of the storage of umbilical cord stem cells, in the name of obtaining biological security for the future. Discussions: This search is populated by risk speeches that offer "guarantees" related to somatic futures, associated with educational practices that produce ways of taking care of children. CONCLUSION: Such speeches produce meanings about issues involving biological safety and risks, enrolling fathers and mothers in practices of hyperprevention in health.

INTRODUCCIÓN: Este artículo tiene el objetivo de comprender cómo la adherencia a la biotecnología del almacenamiento de células madre del cordón umbilical para uso autólogo produce la adopción de prácticas, en el presente, que apuntan a prevenir riesgos en nombre de la seguridad biológica en el futuro. MÉTODO: El material empírico consistió en declaraciones extraídas de sitios de biobancos privados acreditados por ANVISA, analizadas a partir del análisis del discurso. RESULTADOS: las publicaciones en los sitios fomentan el consumo de almacenamiento de células madre en el cordón umbilical, en nombre de la obtención de seguridad biológica para el futuro. Discusiones: esta búsqueda está poblada por discursos de riesgo que ofrecen "garantías" relacionadas con futuros somáticos, asociados con prácticas educativas que producen formas de cuidar a los niños. CONCLUSIÓN: Tales discursos producen significados sobre temas que involucran seguridad y riesgos biológicos, inscribiendo a padres y madres en prácticas de hiperprevención en salud.

Effect of low-density lipoproteins and trehalose on the quality of cryopreserved bovine semen / Efecto de las lipoproteínas de baja densidad y la trehalosa en la calidad del semen bovino criopreservado / Efeito das lipoproteínas de baixa densidade e trealose na qualidade do sêmen bovino criopreservado

Abstract Background: In artificial insemination, chicken egg yolk is added to bovine semen to protect it during the cryopreservation process, although it contains substances that can affect the microbiological quality and metabolism of sperm. Objective: To evaluate post-thaw quality of bovine cryopreserved semen added with centrifuged and non-centrifuged egg yolk, low-density lipoproteins (LDL), and trehalose (T). Methods: Ten ejaculates from five bulls were cryopreserved under the treatments T1: pure egg yolk (PEY) at 20% v/v, T2: centrifuged egg yolk (CEY) at 20% v/v, T3: LDL at 8% v/v, T4: T at 100 mM, and T5: T at 100 mM plus LDL at 8% v/v (TLDL). Spermatic motility and kinetics, functional membrane integrity (FMI), structural membrane integrity (SMI), sperm vitality (SV) and abnormal morphology (AM) were assessed using the Sperm Class Analyzer (SCA®) system, hypoosmotic test (HOST), SYBR/PI probes, and eosin-nigrosin staining, respectively. A completely randomized design was used. Normal distribution of the variables was validated through the Kolmogórov- Smirnov test. A generalized linear model was used to determine sources of variation. Means were compared using the Tukey test. Results: Inclusion of CEY or LDL had a similar effect on sperm protection, and were superior for motility, kinetics and membrane integrity compared to the other treatments (p<0.05). CEY was superior for progressive motility (p<0.05). The cryoprotective action of LDL was similar to TLDL for motility and kinetics, SMI, SV, and AM (p<0.05). Inclusion of PEY and T resulted in the lowest semen quality (p<0.05). The use of T resulted in a reduction in FMI and SMI (p<0.05). No differences in AM between treatments were found (p>0.05). Conclusions: Egg yolk can be replaced by centrifuged egg yolk or low-density lipoproteins in the freezing extender used for bovine semen used in artificial insemination.

Resumen Antecedentes: la yema de huevo de gallina se agrega al semen bovino usado en inseminación artificial para protegerlo durante el proceso de criopreservación, aunque ésta tiene sustancias que pueden afectar el metabolismo espermatico y la calidad microbiológica del semen. Objetivo: evaluar la calidad post-descongelación del semen bovino criopreservado agregado con yema de huevo centrifugada y no centrifugada, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y trehalosa (T). Métodos: diez eyaculados de cinco toros se criopreservaron bajo los tratamientos, T1: yema de huevo pura (PEY) al 20% v/v, T2: yema de huevo centrifugada (CEY) al 20% v/v, T3: LDL al 8% v/v, T4: T a 100 mM, y T5: T a 100 mM más LDL al 8% v/v (TLDL). La movilidad y la cinética espermática, la integridad funcional de la membrana (FMI), la integridad estructural de la membrana (SMI), la vitalidad espermática (SV) y la morfología anormal (AM), se determinaron mediante el sistema Sperm Class Analyzer (SCA®), la prueba hipoosmótica (HOST), las sondas SYBR/PI y la tinción con eosina-nigrosina, respectivamente. Se utilizó un diseño completamente al azar. La normalidad de las variables se validó mediante la prueba de Kolmogórov-Smirnov. Se utilizó un modelo lineal generalizado para determinar las fuentes de variación. Las medias de los tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey. Resultados: CEY y LDL tuvieron un efecto similar en la protección de los espermatozoides, siendo superiores a los demás tratamientos respecto a movilidad, cinética e integridad de la membrana (p<0,05). CEY fue superior para la movilidad progresiva (p<0,05). La acción crioprotectora de LDL fue similar a TLDL para movilidad y cinética, SMI, AM y SV (p<0,05). PEY y T resultaron en la más baja calidad seminal (p<0,05). El uso de T redujo la FMI y la SMI (p<0,05). No se encontraron diferencias en AM entre los tratamientos (p>0,05). Conclusiones: la yema de huevo puede reemplazarse por yema de huevo centrifugada o por lipoproteinas de baja densidad en el diluyente de congelación usado para semen bovino destinado a inseminacion artificial.

Resumo Antecedentes: a gema de ovo de galinha tem sido utilizada com a finalidade de proteger o sêmen bovino durante o processo de criopreservação, embora tenha substâncias que possam afetar o metabolismo dos espermatozóides e a qualidade microbiológica do sêmen utilizado para a inseminação artificial. Objetivo: avaliar a qualidade pós-descongelamento do sêmen bovino criopreservado com gema de ovo centrifugada e não centrifugada, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e trealose (T). Métodos: dez ejaculados de cinco touros foram criopreservados sob os tratamentos, T1: gema de ovo pura (PEY) 20% v/v, T2: gema de ovo centrifugada (CEY) 20% v/v, T3: LDL 8% v/v, T4: T 100 mM e T5: T 100 mM mais LDL 8% v/v (TLDL). Mobilidade e cinética espermática, integridade funcional da membrana (FMI), integridade estrutural da membrana (SMI), vitalidade espermática (SV) e morfologia anormal (AM) foram determinadas por o sistema Sperm Class Analyzer (SCA®), teste hiposmótico (HOST), coloração com SYBR/PI e eosina-nigrosina, respectivamente. Um design completamente aleatoriedade foi usado. A normalidade das variáveis foi validada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Um modelo linear generalizado foi utilizado para determinar as fontes de variação. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey. Resultados: T2 (CEY) e T3 (LDL) tiveram efeito similar na proteção espermática, sendo superior aos demais tratamentos para mobilidade, cinética e integridade da membrana (p<0,05). T2 (CEY) foi superior para mobilidade progressiva (p<0,05). A ação crioprotetora de T3 (LDL) foi semelhante à T5 (TLDL) para motilidade e cinética, SMI, SV e AM (p<0,05). T1 (PEY) e T4 (T) tiveram a menor qualidade seminal (p<0,05). O uso de T4 (T) produziu uma redução na SMI e FMI (p<0,05). Não foram encontradas diferenças na AM entre os tratamentos (p>0,05). Conclusões: a gema de ovo pode ser substituída por gema de ovo centrifugada ou lipoproteínas de baixa densidade no diluente de congelamento de sêmen bovino.

Ex vivo retrieval of mature oocytes for fertility preservation in a patient with bilateral borderline ovarian tumor / Recuperação ex vivo de oócitos maduros para preservação da fertilidade em paciente com tumor ovariano borderline bilateral

Abstract We report a case of ultrasound-guided ex vivo oocyte retrieval for fertility preservation in a woman with bilateral borderline ovarian tumor, for whom conventional transvaginal oocyte retrieval was deemed unsafe because of the increased risk of malignant cell spillage. Ovarian stimulation with gonadotropins was performed. Surgery was scheduled according to the ovarian response to exogenous gonadotropic stimulation; oophorectomized specimens were obtained by laparoscopy, and oocyte retrieval was performed ~ 37 hours after the ovulatory trigger. The sum of 20 ovarian follicles were aspirated, and 16 oocytes were obtained.We performed vitrification of 12 metaphase II oocytes and 3 oocytes matured in vitro. Our result emphasizes the viability of ex vivo mature oocyte retrieval after controlled ovarian stimulation for those with high risk of malignant dissemination by conventional approach.

Resumo Relatamos um caso de obtenção ex vivo de óvulos, guiada por ultrassonografia, para preservação da fertilidade em uma mulher com tumor ovariano borderline bilateral, para quem a recuperação transvaginal convencional foi considerada insegura, devido ao aumento do risco de disseminação de célulasmalignas. Foi realizada estimulação ovariana com gonadotrofinas. A cirurgia foi agendada de acordo com a resposta ovariana à estimulação gonadotrófica exógena; após ooforectomia por laparoscopia, ~ 37 horas após a maturação folicular, procedeu-se à recuperação extracorpórea de oócitos. Umtotal de 20 folículos ovarianos foi aspirado e 16 complexos cumulus foramobtidos, resultando na vitrificação de 12 oócitos maduros e de 3 oócitos imaturos amadurecidos in vitro. Nosso resultado enfatiza a viabilidade da recuperação ex vivo de oócitos maduros após estimulação ovariana controlada para mulheres com alto risco de disseminação maligna pela captação oocitária realizada convencionalmente pela via transvaginal.

Efeito da adição do ácido palmítico e da vitamina E ao diluidor Tris-gema na criopreservação de sêmen canino / Effect of addition of palmitic acid and Vitamin E to the Tris-egg yolk diluter in canine semen cryopreservation

Canine sperm is a very delicate cell that is quite susceptible to oxidative stress since the cytoplasm is restricted and features little antioxidant reserves. Furthermore, the sperm membrane has some polyunsaturated fatty acids sensitive to lipid peroxidation, which makes it important to addition antioxidant substances to the diluter aiming at decreasing such stress to the sperm cell, particularly during seminal cryopreservation. Several antioxidants have been used in this process in some domestic animal's species, however, the use of palmitic acid has been little reported in works on cryopreservation of semen of the canine species. Hence, this study aimed to assess the effect of addition antioxidants palmitic acid and vitamin E to the Tris-egg yolk diluter on the semen quality of dogs after thawing. Samples were collected from the ejaculates of 4 adult dogs, apparently healthy, of the American Pit Bull Terrier breed of kennels in the city of Teresina, PI, places where the pre-freezing procedures of the dog's semen were performed. The samples were diluted in Tris citric acid fructose (3.28 g Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 1.78 g citric acid monohydrate and 1.25 g D-fructose), dissolved in 100 mL distilled water, and added 20% egg yolk and 6% glycerol, at the concentration of 100x106 sptz/mL. The semen samples were divided into 3 mL aliquots to form 3 experimental groups: G1 - Only Tris-egg yolk (Control group); G2 - Tris-egg yolk + 100 µM palmitic acid; and G3 - Tris-egg yolk + 116 µM vitamin E. Semen was collected weekly over a period of little over 2 months. After thawing, thermorresistance test (TTR) was carried out at 0, 30, 60, and 90 min to assess spermatics motility and vigor, in addition to analysis of integrity of plasma membrane, acrosomal membrane and mitochondrial activity of the sperm, using fluorescent probes. These assessments were performed out at the Animal Reproduction Biotechnology Laboratory (LBRA/UFPI). In the TTR, G2 and G3 didn't exhibit significant results for spermatics motility or vigor when compared with the control group. The palmitic acid and vitamin E also had no significant effects on the parameters of acrosomal membrane integrity or mitochondrial activity. However, sperm cryopreserved with the addition of palmitic acid exhibited significant differences for plasma membrane integrity, providing greater protection to the sperm cells in G2. The palmitic acid is one of the most saturated fatty acids in human semen, with reports of great proportions also in the seminal plasma of dogs. Its main role is to protect the plasma membrane from external damage, improving viability and fertility of the sperm after cryopreservation. Data is scarce in the literature on the composition of fatty acids in canine semen and regarding the use of palmitic acid as a seminal antioxidant in that species, which grants further studies aiming to investigate such valuable information for canine reproduction. It is concluded that addition palmitic acid at 100µM concentration to the Tris-egg yolk diluter was able to preserve the integrity of the plasma membrane during the process of cryopreservation of canine semen.(AU)

Freeze-all policy for in vitro fertilization in women with normal response to ovarian stimulation / Congelamento de todos os embriões em ciclos de fertilização in vitro em mulheres com resposta normal à estimulação ovariana

ABSTRACT Objective To answer the question if the freeze-all strategy and subsequent frozen embryo transfer is preferable to fresh embryo transfer for patients with normal response to ovarian stimulation (4 to 15 oocytes recovered) during in vitro fertilization treatments. Methods A retrospective cohort from two human reproduction centers between 2013 and 2017. A total of 471 frozen embryo transfers from freeze-all cycles, and 3,208 fresh transfers were included. Results After propensity score matching adjustment for age and number of eggs, 467 freeze-all cycles and 934 fresh cycles were analyzed, revealing no statistically significant difference between groups in relation to clinical pregnancy rate (32.5% in the Freeze-all Group and 32.3% in the Fresh Group, p=0.936). For women aged 40 years and older, we observed a statistically significant higher clinical pregnancy rate when freeze-all strategy was used (29.3% in the Freeze-all Group and 19.8% in the Fresh Group, p=0.04). Conclusion Freeze-all strategy was not superior to fresh transfer for all patients with normal response to ovarian stimulation. However, women aged 40 years and older could benefit from this strategy. This deserves further investigation in future research, preferable in a prospective randomized study.

RESUMO Objetivo Responder à pergunta se a estratégia freeze-all (congelamento de todos os embriões) e subsequente transferência de embriões congelados é preferível à transferência de embriões a fresco em pacientes com resposta normal à estimulação ovariana (4 a 15 ovócitos coletados) durante tratamentos de fertilização in vitro . Métodos Coorte retrospectiva de dois centros de reprodução humana entre 2013 e 2017. No total, foram incluídas 471 transferências de ciclos com congelamento de todos os embriões, e 3.208 transferências a fresco. Resultados Após o ajuste do escore de propensão para idade e número de óvulos, foram analisados 467 ciclos com congelamento de todos os embriões e 934 ciclos a fresco, não havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à taxa de gravidez clínica (32,5% no Grupo Freeze-all e 32,3% no Grupo a Fresco, p=0,936). Para mulheres com 40 anos ou mais, observamos uma taxa de gravidez clínica estatisticamente maior quando foi utilizada a estratégia freeze-all (29,3% no Grupo Freeze-all e 19,8% no Grupo a Fresco, p=0,04). Conclusão A estratégia freeze-all não foi superior à transferência a fresco para todas as pacientes com resposta normal à estimulação ovariana. No entanto, mulheres com 40 anos ou mais podem ter algum benefício com essa estratégia. Isso justifica uma investigação mais aprofundada em pesquisas futuras e, de preferência, em estudos prospectivos randomizados.

Crioconservación seminal en peces de agua dulce: aspectos biotecnológicos, celulares y bioquímicos / Seminal Cryopreservation in Freshwater Fish: Biotechnological, Cellular and Biochemical Aspects / Criopreservação Seminal em Peixes de Água Doce: Aspectos Biotecnológicos, Celulares e Bioquímicos

Resumen La crioconservación es una herramienta biotecnológica que en peces está orientada principalmente a la conservación criogénica de semen como estrategia de preservación del recurso genético y a su uso para la producción de alevinos con fines diferentes. Actualmente, los protocolos de crioconservación seminal en peces de agua dulce establecen una amplia variedad de procedimientos cuya efectividad se basa en aspectos ligados a la calidad seminal post-descongelación y la fertilidad, así como su relación con el desarrollo de la progenie. El efecto de la conservación del semen en nitrógeno líquido por periodos amplios de tiempo también toma importancia en ésta biotecnología. Por lo anterior, el objetivo de la presente revisión es describir aspectos biotecnológicos, celulares y bioquímicos asociados al proceso de crioconservación seminal en peces dulceacuícolas, resaltando los avances, las limitaciones y sus perspectivas.

Abstract Cryopreservation is a biotechnological tool that in fish is mainly aimed at cryogenic conservation of semen as a strategy for preserving the genetic resource and its use for the production of fingerlings with different purposes. Currently, seminal cryopreservation protocols in freshwater fish establish a wide variety of procedures whose effectiveness is based on aspects linked to seminal post-thaw quality and fertility, as well as its relationship with the development of the progeny. The effect of preserving semen in liquid nitrogen for extended periods of time also plays an important role in this biotechnology. Therefore, the objective of this review is to describe biotechnological, cellular and biochemical aspects associated with the seminal cryopreservation process in freshwater fish, highlighting the advances, limitations and perspectives.

Resumo A criopreservação é uma ferramenta biotecnológica que em peixes visa principalmente a conservação criogênica do sêmen como estratégia para a preservação do recurso genético e sua utilização para a produção de alevinos para diferentes fins. Atualmente, os protocolos de criopreservação seminal em peixes de água doce estabelecem uma ampla variedade de procedimentos cuja eficácia se baseia em aspectos relacionados à qualidade e fertilidade pós-descongelamento seminal, bem como sua relação com o desenvolvimento da progênie. O efeito da preservação do sêmen no nitrogênio líquido por longos períodos de tempo também desempenha um papel importante nessa biotecnologia. Portanto, o objetivo desta revisão é descrever aspectos biotecnológicos, celulares e bioquímicos associados ao processo de criopreservação seminal em peixes de água doce, destacando os avanços, limitações e perspectivas.

Protein profile as a quality indicator of cryopreserved semen from Tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) / Perfil protéico como indicador qualitativo do semen criopreservado de Tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818)

Abstract The aim of this study was to evaluate the association between proteins in the seminal plasma of tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) with seminal quality indicators after thawing. The semen was cryopreserved with a dilution based on BTS with 8% DMSO. A 200 µL sample of semen from each animal was diluted in 800 µL BTS, centrifuged at 800 rpm, and the supernatant was cryopreserved to further analyze of the protein profile of seminal plasma through one-dimensional electrophoresis (SDS-PAGE). After 15 days of cryopreservation, a cryopreserved semen straw was thawed to analyze both qualitative and quantitative parameters. When considering all collections, the SDS-PAGE identified 15 protein bands in the seminal plasma of tambaqui. When the interaction (presence or absence) between proteins observed in the seminal plasma and the post thawed spermatic parameters was evaluated, we observed a great influence of the presence of proteins on spermatic quality. A greater (P<0.05) fertilization rate was observed with the presence of proteins 12, 34, 44, 85, and 90 kDa. Proteins in seminal plasma of tambaqui influenced the spermatic quality after thawing, and thus, they can be utilized as an indicator of sperm quality, especially the proteins with a molecular weight ≤ 50 kDa.

Resumo O objetivo desse estudo foi de avaliar a associação entre a presença de proteínas no plasma seminal do tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) com indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento. O semen foi criopreservado com diluidor a base de BTS com 8% DMSO. Uma amostra de 200 µL de semen de cada animal foi diluída em 800 µL de BTS, e centrifugada em 800 rpm, e somente o sobrenadante foi criopreservado para posterior análise do perfil proteico do plasma seminal, através da eletroforese unidimensional (SDS-PAGE). Decorridos 15 dias da criopreservação, uma palheta com semen criopreservado foi descongelado para análise dos parâmetros quali-quantitativos. Considerando todas as coletas, o SDS-PAGE identificou 15 bandas proteicas no plasma seminal do tambaqui. Quando se avaliou a interação (presença ou ausência) das proteínas encontradas no plasma seminal, com os parâmetros espermáticos pós-descongelamento, observou-se grande influência da presença das proteínas na qualidade espermática. Observou-se maior taxa de fertilização (P<0,05) com a presença das proteínas 12, 34, 44, 85 e 90 kDa. As proteínas do plasma seminal de tambaqui influenciaram na qualidade espermática após descongelamento, podendo ser utilizadas como indicadores para a qualidade espermática após descongelamento, principalmente as proteínas com peso molecular ≤50 kDa.

Avaliação morfológica do concentrado autólogo de plaquetas em cães sob refrigeração e criopreservação em DMSO 6% / [Morphological evaluation of the autologous platelet concentrate in dogs under refrigeration and criopreservation in 6% DMSO]

The morphological characteristics of the autologous platelet concentrate (APC) of 31 dogs were evaluated after cooling and freezing in 6% DMSO. Blood from the jugular vein of each patient was collected and centrifuged at 191g for six minutes to obtain APC. In the fresh sample, the platelet count, MPV, PDW and cell morphology were evaluated. Four samples of each animal were sent for storage, one refrigerated at 4°C for seven days, another for 30 days and two more stored in a freezer at -80°C in the same time interval, using 6% DMSO as cryoprotectant. The conserved samples were submitted to the same laboratory analysis as the fresh sample. There was a difference between fresh and preserved samples for platelet count, cell concentration, MPV and PDW (P<0.05), except in the 30-day refrigerated group, which showed severe morphological changes. In the frozen group for seven days, no difference was observed in the percentage of activation (P>0.05). The results obtained lead to the conclusion that cryopreservation with 6% DMSO at -80°C for seven days is a favorable option for the maintenance of platelet concentrations and the morphological characteristics of APC in dogs.(AU)

Insulina e IGF-1 no meio extensor de criopreservação seminal bovina / Insulin and IGF-I in extender medium for bovine semen cryopreservation

Objetivou-se avaliar a condição metabólica e estrutural das células espermáticas bovinas após congelação, com adição prévia de IGF-I e insulina no meio diluidor seminal. Os ejaculados de seis touros Nelore foram submetidos a quatro tratamentos: controle; insulina (100µUI/mL); IGF-I (150ng/mL) e insulina + IGF-I (50µUI/mL e 75ng/mL, respectivamente). Após a congelação, realizaram-se os testes de termorresistência rápida, coloração pelo corante azul de tripan e Giemsa, além da análise computadorizada da motilidade espermática, da integridade das membranas plasmática e acrossomal, e da peça intermediária por meio de sondas fluorescentes. O teste de termorresistência rápida apresentou efeito dentro do tempo de cada tratamento, mas não entre os tratamentos. Na análise computadorizada da motilidade espermática, foram observados movimento, motilidade e velocidade espermáticos; não houve efeitos dos tratamentos sobre qualquer uma dessas variáveis. Respostas iguais foram obtidas com as sondas fluorescentes e o corante azul de tripan/Giemsa. A adição de insulina e IGF-I, de forma isolada ou combinada, ao meio diluidor para congelação de sêmen não produziu efeitos sobre as condições metabólica e estrutural das células espermáticas.(AU)

This study aimed to evaluate the metabolic and structural condition of the spermatic bovine cells after the freezing, with addition, previously, of IGF-I and Insulin in the seminal thinner medium. The semen of 6 Nellore bulls were submitted to four treatments: Control, Insulin (100µUI/mL); IGF-I (150ng/mL) and Insulin + IGF-I (50µUI/mL and 75ng/mL, respectively). After freezing, rapid resistance tests, Tripan and Giemsa Blue staining, and computerized analysis of sperm motility and integrity of the plasma and acrosomal membranes and the intermediate part were performed by fluorescent probes. The term rapid resistance test had effect within the time of each treatment, but not between treatments. In the computer analysis of sperm motility, sperm movement, motility and velocity no effects of treatments were observed on any of these variables. The same results were obtained with the fluorescent probes and the Blue dye Trypan / Giemsa. The addition of Insulin and IGF-I, alone or in combination, to the semen freezing dilution medium had no effect on the metabolic and structural condition of sperm cells.(AU)

Adult mesenchymal stem cells and their possibilities for Dentistry: what to expect?

ABSTRACT Introduction: Stem cells obtained from the pulp of human deciduous teeth are highly proliferative and plastic multipotent cells, which makes them a relevant model of stem cells, applied in several biomedical areas, with different purposes. Objective: Based on a brief review of the literature, the present work intends to present from conceptual aspects about stem cells, classifications, potential (in vitro and in vivo) applications in dental practice, cell culture, cryopreservation and its importance, ethical and regulatory aspects, as well as the role of the dental surgeon as the endorser responsible for the entire clinical stage that involves the process of collecting stem cells obtained from dental pulps for cryopreservation, with a view to using them under appropriate conditions, in accordance with scientifically proven and justified good laboratory and clinical practices.

RESUMO Introdução: As células-tronco obtidas a partir da polpa de dentes decíduos humanos são células multipotentes altamente proliferativas e plásticas, o que as torna um modelo relevante de células-tronco, aplicado em diversas áreas biomédicas, com diferentes propósitos. Objetivo: A partir de uma breve revisão da literatura, o presente trabalho pretende apresentar desde aspectos conceituais acerca das células-tronco, classificações, potenciais aplicações (in vitro e in vivo) na prática odontológica, cultivo celular, criopreservação e sua importância, aspectos éticos e regulatórios, bem como o papel do cirurgião-dentista como homologador responsável por toda a etapa clínica que envolve o processo de coleta das células-tronco obtidas a partir de polpas dentais para criopreservação, com vistas ao uso em condições adequadas, em acordo com as boas práticas laboratoriais e clínicas cientificamente comprovadas e justificadas.

Effect of refrigeration at -1°C on spermatozoa quality of domestic cats / Efeito da refrigeração a -1°C na qualidade de espermatozoides de gatos domésticos

The objective of this study was to evaluate the sperm quality obtained of domestic cats by electroejaculation and recovery of the tail of the epididymis after cooling at -1°C and 4°C for 24 and 48 hours. Twenty-nine adult cats (2 to 6kg) were used. Sperm collection was performed by electroejaculation (EEJ), and after 48 hours, the cats were orchiectomized, and sperm sample was obtained from the vas deferens and epididymis tail (EPD). The samples were diluted in ACP-117® extender, and the sperm characteristics were evaluated at three different moments: when still fresh, 24 and 48 hours after cooling. The objective of this study was to evaluate the sperm quality obtained of domestic cats by electroejaculation and recovery of the tail of the epididymis after cooling at -1°C and 4°C for 24 and 48 hours. Twenty-nine adult cats (2 to 6kg) were used. Sperm collection was performed by electroejaculation (EEJ), and after 48 hours, the cats were orchiectomized, and sperm sample was obtained from the vas deferens and epididymis tail (EPD). The samples were diluted in ACP-117® extender, and the sperm characteristics were evaluated at three different moments: when still fresh, 24 and 48 hours after cooling. In order to compare the two refrigeration temperatures, the first stage was to analyze if there was a difference between the harvesting techniques. After this, two experiments were conducted: in the first, sperm sample from 14 cats were used and the cooling was performed at -1°C; and in the second, sample from 15 cats were used and the sperm were refrigerated at 4°C. Sperm kinetics were evaluated by computerized analysis (CASA) and concentration by Neubauer chamber, spermatic morphology was evaluated by modified Karras staining, and membrane integrity was evaluated by eosin nigrosine. The results obtained were analyzed in R software, version 3.2.5 using the Mann-Whitney test for variables with abnormal distributions, considering significance at the level of 5%. In ejaculate samples, higher values of total morphological defects were observed after 24 and 48 hours of refrigeration at 4°C (P<0.022) compared to refrigeration at -1°C, using Friedman test. To quantify the decrease in sperm quality, parameter reductions were calculated among time points (F-24h/F-48h/24h-48h). In EPD samples, a greater reduction in sperm quality was detected after 24 hours of refrigeration at 4°C, both in motility and sperm kinetics and in the movement and velocity indices, compared to refrigeration at -1°C. Based on the results, it can be concluded that cooling of feline spermatozoa at -1°C for up to 48 hours was efficient in maintaining spermatic quality collected by EEJ and EPD, and it could be an alternative to spermatozoa cryopreservation in domestic felines.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade espermática de gatos domésticos obtidos por eletroejaculação e recuperação da cauda do epidídimo após a refrigeração a -1°C e a 4°C por 24 e 48 horas. Vinte e nove gatos adultos (2 a 6kg) foram utilizados. A colheita de espermatozoides foi realizada por eletroejaculação (EEJ) e, após 48 horas, os gatos foram orquiectomizados, e as amostras espermáticas foram obtidas a partir do ducto deferente e da cauda do epidídimo (EPD). As amostras foram diluídas em ACP-117® e as características espermáticas foram avaliadas em três momentos distintos: fresco, 24 e 48 horas após a refrigeração. Para ser possível comparar as duas temperaturas de refrigeração, a primeira etapa foi analisar se havia diferença entre as técnicas de colheita. Após isto, dois experimentos foram conduzidos: no primeiro, espermatozoides de 14 gatos foram utilizados e a refrigeração foi realizada a -1°C; e no segundo, amostras de 15 gatos foram utilizados e os espermatozoides foram refrigerados a 4°C. A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA), a concentração por câmara de Neubauer, a morfologia espermática foi avaliada pela coloração de Karras modificada, e a integridade da membrana foi avaliada por eosina nigrosina. Os resultados obtidos foram analisados no software R, versão 3.2.5, utilizando o teste de Mann-Whitney para variáveis com distribuições anormais, considerando significância ao nível de 5%. No ejaculado, maiores valores de defeitos morfológicos totais foram observados após 24 e 48 horas de refrigeração a 4°C (P<0,022) em comparação com refrigeração a -1°C, usando o teste de Friedman. Para quantificar a diminuição na qualidade espermática, as reduções dos parâmetros foram calculadas entre os pontos de tempo (F-24h/F-48h/24h-48h). Na EPD, uma maior redução na qualidade espermática foi detectada após 24 horas de refrigeração a 4°C, tanto na motilidade e na cinética espermática quanto nos índices de movimento e velocidade, em comparação com a refrigeração a -1°C. Com base nos resultados, pode concluir-se que a refrigeração dos espermatozoides felino a -1°C, até 48 horas, foi eficaz na manutenção da qualidade espermático colhidos por EEJ e EPD, e pode ser uma alternativa para a criopreservação de espermatozoides em felinos domésticos.(AU)

Efeito do ácido docosa-hexaenoico e do Trolox® no diluidor de refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador / Effect of docosahexaenoic acid and Trolox® in extenders for cooling semen from Mangalarga Marchador stallion

Objetivou-se avaliar o efeito do ácido docosa-hexaenoico (DHA), associado ou não ao Trolox®, na refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Foram refrigerados 10 ejaculados nos diluidores: D1) BotuSêmen® (BS; controle); D2) BS + 30ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40µM de Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40µM de Trolox® (BS50DHA40T). Após 48 horas de refrigeração, foram avaliados os parâmetros de movimento espermático, a integridade estrutural e funcional da membrana plasmática e a longevidade espermática. Todos os diluidores testados preservaram, de forma semelhante, a motilidade, a linearidade, a retilinearidade, a amplitude do deslocamento lateral da cabeça, a frequência do batimento flagelar cruzado, o percentual de hiperativos e a integridade estrutural e funcional da membrana espermática (P>0,05). O diluidor BS50DHA foi superior ao BS30DHA40T em preservar a VCL e a VSL e foi superior ao BS30DHA40T e ao BS50DHA40T em preservar a VAP e o índice de oscilação (P<0,05). Conclui-se que o uso do Trolox® em diluidores utilizados para refrigeração de sêmen de garanhões contendo ácido docosa-hexaenoico, nas concentrações propostas, não é indicado por alterar parâmetros de movimento espermático considerados importantes para a fertilidade.(AU)

The objective of this study was to evaluate the effect of docosahexaenoic acid (DHA), associated or not with Trolox®, in extenders for cooling semen from Mangalarga Marchador stallions. Ten ejaculates were cooled in the following diluents: D1) BotuSemen® (BS; control); D2) BS + 30ngmL-1 DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40µM Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50ngmL-1 DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40µM Trolox® (BS50DHA40T). After 48 hours of refrigeration, the sperm movement, structural and functional integrity of the plasma membrane and sperm longevity were evaluated. All extenders tested similarly preserved motility, linearity, straightness of trajectory, amplitude of lateral head displacement, beat cross frequency, hyperactive, the structural and functional integrity of the sperm membrane (P> 0.05). The BS50DHA extender was superior to BS30DHA40T in preserving VCL and VSL and was superior to BS30DHA40T and BS50DHA40T in preserving VAP and oscillation index (P< 0.05). It is concluded that the use of Trolox® in extenders for cooling stallion sperm containing docosahexaenoic acid at the proposed concentrations is not indicated because it alters sperm movement parameters considered important for fertility.(AU)

Criopreservação de células-tronco de origem dentária: uma revisão de literatura / Cryopreservation of stem cells of dental origin:a literature review

Introdução: Os tecidos dentários são uma fonte acessível de células--tronco mesenquimais que podem ser úteis para o tratamento de va-riadas doenças clínicas. Logo, o interesse e a necessidade de garantir uma forma eficaz de conservar as células-tronco de origem dentá-ria para aplicações futuras levou ao desenvolvimento de métodos de criopreservação, técnica pela qual são aplicadas baixas tempe raturas para cessar de maneira reversível e controlada as funções biológicas de células e tecidos vivos. Objetivo: Realizar uma revisão de literatura acerca da criopreservação de células-tronco de origem dentária, enfatizando características, princípios, protocolos existen-tes e efeitos desse método às propriedades biológicas dessas células. Metodologia: Este estudo constituiu numa revisão de literatura com base nas informações de 54 artigos científicos publicados no período entre 2005 e 2019 e consultados em bases de dados on-line (Pub-Med, SciELO e Google Acadêmico), com a utilização dos seguin-tes descritores: Criopreservação (Cryopreservation), Células-tronco dentárias (Dental stem cells) e Criopreservação dental (Dental cryo-preservation). Resultados: Verificou-se que as células-tronco de ori-gem dentária parecem manter suas características biológicas, como a taxa de viabilidade, proliferação celular e ampla capacidade de di-ferenciação mesmo após a criopreservação. Além disso, a criopre-servação magnética apresenta-se como um protocolo promissor para a conservação de células-tronco dentárias. Conclusão: A criopre-servação é uma técnica eficaz para o armazenamento a longo prazo de células-tronco derivadas de tecidos dentários. Entretanto, estudos adicionais devem ser realizados em busca do desenvolvimento de protocolos de criopreservação mais padronizados e seguros que não afetem as propriedades biológicas das células-tronco dentárias.

Introduction: Dental tissues are an accessible source of mesenchymal stem cells that can be useful for the treatment of various clinical diseases. Thus, the interest and the need to ensure an efficient way to preserve stem cells of dental origin for future applications led to the development of cryopreservation methods, a technique by which low temperatures are applied to reverse, in a reversible and controlled manner, biological functions of living cells and tissues. Objective: To perform a literature review about the cryopreservation of stem cells of dental origin, emphasizing characteristics, principles, existing protocols, and effects of this method on the biological properties of these cells. Methodology: This study consisted of a literature review based on information from 54 scientific articles published between 2005 and 2019 and consulted in online databases (PubMed, SciELO, and Google Scholar), using the following descriptors: Cryopreservation, Dental stem cells, and Dental cryopreservation. Results: Stem cells of dental origin seem to maintain their biological characteristics, such as viability rate, cell proliferation, and ample capacity for differentiation even after cryopreservation. Also, magnetic cryopreservation presents itself as a promising protocol for the conservation of dental stem cells. Conclusion: Cryopreservation is an effective technique for the long-term storage of stem cells derived from dental tissues. However, additional studies should be carried out to develop more standardized and safer cryopreservation protocols that do not affect the biological properties of dental stem cells.

Influência de diferentes sistemas e curvas de congelamento na congelabilidade e fertilidade do sêmen equino / Influence of systems and freezing curve in equine semen freezability and fertility

Avaliou-se o efeito de curvas de congelação nos parâmetros espermáticos e na fertilidade, usando sêmen de alta e baixa congelabilidade. Experimento 1 - utilizou-se sêmen de quatro garanhões resistentes à congelação: grupo 1, palhetas refrigeradas até 5°C e congeladas com curva de -8°C/min; grupos 2 e 3, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min.) e congeladas com curvas de -20°C/min e -10°C/min, respectivamente. Experimentos 2 e 3 - utilizaram-se cinco garanhões (Mangalarga Marchador), respectivamente, de alta e baixa congelabilidade: grupo 4, a mesma metodologia descrita no grupo 1; grupos 5 e 6, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min) e congeladas com curva de -20°C/min, entre 5°C e -60°C, e -10°C/min, entre -60°C e -100ºC (grupo 5), e -25°C/min, de 5°C até -100°C (grupo 6). O sêmen foi avaliado após descongelamento pelo método computadorizado. No experimento 1, não houve diferença nos parâmetros avaliados. No experimento 2, os parâmetros motilidade total (MT) e motilidade progressiva foram superiores aos do grupo 6 em relação ao grupo 4. No experimento 3, a MT foi superior no grupo 6 em relação ao grupo 4. As curvas de congelação mais rápidas apresentaram melhores parâmetros de cinética espermática, após a descongelação, para o sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador.(AU)

The effect of freezing curves on sperm parameters and fertility, using resistant and sensitive semen to cryopreservation, was evaluated. In experiment 1, Semen from 4 stallions resistant to freezing was used: Group 1, straws were cooled to 5°C and frozen with a curve of - 8°C/min; Groups 2 and 3, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with curves of - 20°C / min and - 10°C/min, respectively. In experiments 2 and 3, 5 stallions (Mangalarga Marchador) presenting respectively resistant and sensitive sperm to cryopreservation were used: Group 4, same methodology described for Group 1 was performed; Groups 5 and 6, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with a curve of - 20°C/min. between 5°C and - 60°C and -10°C/min. between - 60°C and - 100°C (Group 5) and - 25°C/min. 5°C to - 100°C (Group 6). Thawed-semen was evaluated by the computerized method CASA. In Experiment 1, there was no difference in the evaluated parameters. In Experiment 2, total motility (MT) and progressive motility (PM) were higher in Group 6 compared to Group 4. In Experiment 3, TM was higher in Group 6 than Group 4. The faster freezing curves showed better parameters of sperm kinetics after thawing, for the Mangalarga Marchador stallion semen.(AU)

Phospholipid composition and resistance to vitrification of in vivo blastocyst of a Brazilian naturalized porcine breed / Composição de fosfolipídios e resistência à vitrificação de blastocistos produzidos in vivo de uma raça de suíno naturalizada brasileira

Piau porcine blastocysts were submitted to MALDI-TOF to identify the main phospholipids (PL). After that, in vivo blastocysts (D6) were vitrified (n=52), non-vitrified were used as control (n=42). After warming, blastocysts were in vitro cultured to assess re-expansion and hatching at 24 and 48 hours. Finally, at 48 hours, hatched blastocysts were submitted to RT-qPCR searching for BCL2A1, BAK, BAX and CASP3 genes. For MALDI-TOF, the ion intensity was expressed in arbitrary units. Blastocyst development was compared by Qui-square (P< 0.05). Among the most representative PL was the phosphatidylcholine [PC (32:0) + H]+; [PC (34:1) + H]+ and [PC (36:4) + H]+. Beyond the PL, MALDI revealed some triglycerides (TG), including PPL (50:2) + Na+, PPO (50:1) + Na+, PLO (52:3) + Na+ and POO (52:2) + Na. Re-expansion did not differ (P> 0.05) between fresh or vitrified blastocysts at 24 (33.3%; 32.7%) or 48 hours (2.4%; 13.5%). Hatching rates were higher (P< 0.05) for fresh compared to vitrified at 24 (66.7%; 15.4%) and 48 hours (97.6%; 36.0%). BAX was overexpressed (P< 0.05) after vitrification. In conclusion, Piau blastocysts can be cryopreserved by Cryotop. This study also demonstrated that the apoptotic pathway may be responsible for the low efficiency of porcine embryo cryopreservation.(AU)

Blastocistos de suínos foram submetidos ao MALDI-TOF para se identificarem os principais fosfolipídios (PL). Depois, parte destes embriões (D6) foram vitrificados (n=52), ou permaneceram frescos (grupo controle, n=42). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados in vitro para se avaliar a reexpansão e a eclosão (BE) às 24 e 48 horas. Finalmente, às 48 horas, os BE foram submetidos ao RT-qPCR em busca dos genes BCL2A1, BAK, BAX e CASP3. No MALDI-TOF, a intensidade do íon foi expressa em unidades arbitrárias. O desenvolvimento embrionário foi comparado por qui-quadrado (P<0,05). Entre os PL mais representativos estavam as fosfatidilcolinas [PC (32: 0) + H] +; [PC (34: 1) + H] + e [PC (36: 4) + H] +. Além do PL, o MALDI revelou alguns triglicerídeos (TG), incluindo PPL (50: 2) + Na +, PPO (50: 1) + Na +, PLO (52: 3) + Na + e POO (52: 2) + Na. A reexpansão não diferiu (P>0,05) entre blastocistos frescos ou vitrificados às 24 (33,3%, 32,7%) e 48 horas (2,4%, 13,5%). As taxas de eclosão foram maiores (P<0,05) para o grupo fresco comparado ao vitrificado às 24 (66,7% x 15,4%) e 48 horas (97,6% x 36,0%). O BAX estava mais expresso (P<0,05) após a vitrificação. Concluindo, os blastocistos Piau podem ser criopreservados por Cryotop. Este estudo também demonstrou que a via apoptótica pode ser responsável pela baixa eficiência da criopreservação de embriões suínos.(AU)

Crioconservación seminal de Colossoma macropomum como estrategia de producción y conservación en la Orinoquia Colombiana / Seminal cryopreservation of Colossoma macropomum as a production and conservation strategy in the Colombian Orinoquia / Criopreservação seminal de Colossoma macropomum como estratégia de produção e conservação na Orinoquia Colombiana

Resumen La Cachama negra (Colossoma macropomum) es un pez nativo de Sur América. En Colombia, no hay estudios publicados sobre protocolos estandarizados para su crioconservación seminal. La implementación de esta biotecnología permitiría su producción comercial continua e introducción en bancos de recursos genéticos. El objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos de la crioconservación sobre el semen de C. macropomum sometido a diferentes crioprotectores y sistemas de empaque con miras a consolidar un protocolo eficiente para la especie. Se utilizó semen de tres machos sexualmente maduros (4.6 ± 1.6 kg). El semen fue diluido en una proporción 1:4 usando tres diferentes agentes crioprotectores (Dimetilsulfoxido 10% [DMSO], Metanol 10% [MET], Etilenglicol 5% [ETG]) con o sin la inclusión de yema de huevo 12% (YH) y glucosa 5.5%. Además, fueron evaluados dos sistemas de empaque (pajillas de 0.5 ml y macrotubos de 2.0 ml), las cuales fueron expuestas a vapores de nitrógeno líquido (NL) y luego almacenadas durante 8 meses. El semen fue descongelado en baño de agua a 37°C por 60 s y se determinó la motilidad masal (%) [MM], duración de la motilidad (s) [DM], integridad de membrana plasmática (%) [IMP] y fertilidad (%). La motilidad postdescongelación en todos los tratamientos fue significativamente diferente (P<0,05) al control siendo MET 2.0 ml el mejor (53 ± 5.8%). Respecto al control la DM tuvo un comportamiento similar para todos los tratamientos siendo solo diferente significativamente para ETG+YH 0.5 ml. La IMP se mantuvo sin diferencias significativas en MET 2.0 ml con respecto al control. La fertilidad fue significativamente menor en la mayoría de tratamientos con YH, siendo MET 2.0 ml el mejor (94.7 ± 0.6%). En conclusión, el semen de Colossoma macropomum es susceptible de crioconservación no siendo necesaria la utilización de YH en los diluyentes.

Abstract Cachama Negra (Colossoma macropomum) it´s a native fish of South America. In Colombia, there are no published studies on standardized protocols about their seminal cryopreservation. The implementation of this biotechnology would allow its continuous commercial production and introduction in genetic resources banks. The aim of this study was to evaluate the effects of cryopreservation on C. macropomum sperm subjected to different cryoprotectants and packaging systems in order to consolidate an efficient protocol for this specie. Semen from three sexually mature males (4.6 ± 1.6 kg) was used. The semen was diluted in a 1:4 ratio using three different cryoprotective agents (Dimethylsulfoxide 10% [DMSO], Methanol 10% [MET], Ethylene glycol 5% [ETG]); with or without the inclusion of 12% egg yolk (YH) and glucose 5.5%. In addition, two packing systems were evaluated (0.5 ml straws and 2.0 ml macrotubes), wich were exposed to liquid nitrogen (NL) vapors and then stored for 8 months. The sperm was thawed in a water bath at 37° C for 60 s and was determined the mass motility (%) [MM], motility duration (s) [DM], plasma membrane integrity (%) [IMP] and fertility (%). Post-thaw motility in all treatments was significantly different (P <0.05) to control, being MET 2.0 ml the best (53 ± 5.8%). Respect to the control the DM had a similar behavior for all treatments, being only significantly different for ETG+YH 0.5 ml. The IMP remained without significant differences in MET 2.0 ml with respect to the control. Fertility was significantly lower in the majority of treatments with YH, being MET 2.0 ml the best (94.7 ± 0.6%). In conclusion, semen of Colossoma macropomum is susceptible to cryopreservation, and the use of YH in diluents is not necessary.

Resumo O tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe nativo da América do Sul. Na Colômbia, não há trabalhos publicados sobre protocolos padronizados para sua criopreservação seminal. A implementação dessa biotecnologia permitiria sua produção comercial contínua e sua introdução nos bancos de genes. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da criopreservação no sêmen de C. macropomum submetido a diferentes crioprotectores e envases, e poder consolidar um protocolo eficiente para esta espécie. Foi utilizado sêmen de três machos sexualmente maduros (4.6 ± 1.6 kg). O sémen foi diluído em uma proporção 1:4 usando três diferentes agentes crioprotectores (10% de dimetil sulfóxido [DMSO], 10% de Metanol [MET] Etileno glicol 5% [ETG]), com e sem a presencia de gema de ovo ao 12% (YH) e glucose a 5.5%. Além foram avaliados dos sistemas de envase (palhetas de 0.5 ml e 2.0 ml de macrotubos) que foram expostos a vapores de nitrogênio líquido (NL) e armazenados por 8 meses em NL. O sémen foi descongelado em banho-água a 37 ° C durante 60 segundos e determinou-se a motilidade massal (%) [MM], duração de motilidade (s) [DM], a integridade da membrana plasmática (%) [IMP] e Fertilidade (%). A motilidade pós-descongelação nos tratamentos foi significativamente diferente (P<0.05) sendo a melhor combinação MET 2.0 ml (53 ± 5.8%) comprados com o controle. Em relação ao controle, o DM teve um comportamento similar para todos os tratamentos sendo significativamente diferente para o ETG+YH 0.5 ml. O IMP permaneceu sem diferenças significativas no MET 2.0 ml em relação ao controle. A fertilidade foi significativamente menor na maioria dos tratamentos com YH, sendo o MET 2.0 ml o melhor (94.7 ± 0.6%). Em conclusão, o sêmen Colossoma macropomum é suscetível à criopreservação e o uso de YH em diluentes não é necessário.